尊龙凯时 Cre-LoxP系统是一种基于位点特异性重组的基因编辑技术,主要由Cre重组酶和LoxP位点组成。Cre(Cyclization recombination enzyme)是一种由噬菌体P1产生的38kDa DNA重组酶,包含343个氨基酸。它能特异性识别LoxP位点的特定DNA序列,介导两个LoxP位点之间DNA序列的重组。
LoxP位点由34个碱基对(bp)构成,包括两个13bp的反向回文序列和一个8bp的中间间隔序列。反向回文序列是Cre重组酶的结合位点,间隔区域确定了LoxP位点的特异性,而两个LoxP位点之间的相对方向则决定了重组的类型。Cre-LoxP系统的核心优势在于其高效性和特异性,能够在活体动物中实现基因的点位敲除、插入、翻转和易位等操作。自20世纪80年代末首次被描述以来,该系统已广泛应用于基因功能研究、疾病模型构建及神经科学研究等领域。
当基因中存在LoxP位点且Cre重组酶存在时,Cre重组酶可以特异性识别LoxP位点两侧的反向重复序列,与之结合形成二聚体。接下来,这些二聚体会结合其他LoxP位点的二聚体,形成四聚体,随后Cre重组酶切割LoxP位点之间的DNA序列,导致DNA断裂。最后,DNA断裂末端通过DNA连接酶的作用重新连接,完成重组过程。根据LoxP位点的方向和位置,Cre酶能够执行以下几种基因操作:删除、翻转、易位和交换。
自Cre-LoxP系统问世以来,科学家们对其进行了多项优化,开发出各种突变版本,以提高其在不同生物体和条件下的应用效率和特异性。通过对LoxP位点序列的改造,衍生出了如Lox2272、Lox511、Lox5171、LoxN等变体,这些变体在不同生物体中表现出更高的识别和切割效率,可以通过组合使用实现更复杂的基因重组。
LSL(LoxP-Stop-LoxP)系统是基于Cre-LoxP技术的条件性基因表达工具,其主要设计是将由LoxP位点包围的终止盒插入目标基因上游。当Cre重组酶存在时,LoxP位点之间的DNA序列(包括终止盒)会被切除,从而解除对目标基因的转录阻断,使其在特定启动子的驱动下表达。
FLEX(Flip-Excision)系统则通过在目标基因两侧设计不同方向或类型的LoxP位点,实现Cre重组酶介导的连续重组事件,可以先翻转基因片段方向,再切除特定序列,进而实现基因表达的双向调控。DIO(Double-Floxed Inverted Orientation)系统是FLEX系统的优化版本,其中特定基因的开放阅读框(ORF)被设计为反向排列,Cre重组酶的作用使得目标基因的方向被翻转,从而激活基因表达。
在DO(Double-Floxed Orientation)系统中,目标基因的开放阅读框被设计为正向排列,并由LoxP和Lox2272位点包围。在没有Cre重组酶的情况下,目标基因能够正常表达。然而,当Cre重组酶存在时,目标基因的方向会被翻转,抑制基因表达。由于LoxP和Lox2272位点的互不兼容,重组后的基因无法再次翻转,从而实现了稳定的基因抑制。
研究人员在转基因小鼠Oxtrflox/flox中,通过Cre-LoxP系统实现单侧SN特异性敲除Oxtr。在病毒注射后的30天进行蛋白质免疫印迹实验以验证敲除效率。此外,利用DIO系统在Vgat-Cre小鼠中表达钙离子指示剂GCaMp6s,观察到在不可预测威胁实验中,vBNST中Vgat神经元的Ca2+信号显著升高。
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