细胞外囊泡（EVs）是细胞自发释放的细胞衍生颗粒，通常由磷脂双分子层构成。EVs存在于各类体液中，如血液和尿液。其特性（如细胞来源、浓度、组成与功能）均与多种疾病密切相关。因此，研究人员正在积极探索EVs作为癌症和心血管疾病等多种疾病的生物标志物。然而，为确保EVs能够作为可靠的生物标志物，必须开发出可靠且可重复的EVs测量方法。目前，EVs生物标志物研究面临主要挑战：不同实验室间测量结果的不可比性，这直接制约了多中心研究的开展，而多中心研究又是临床生物标志物研究的必要条件。

为提高数据的可比性，本研究开发了一种与EVs物理特性相似的新参考材料及参考程序。该新材料与程序的验证需要生物测试样本。我们构建了一种人血浆EVs测试样品（PEVTES），其特点包括：一是外观类似于血浆中的亚细胞颗粒，二是易于使用，三是可与流式细胞仪兼容，四是稳定性良好。

本研究的方法是从三例空腹供体的血浆中制备PEVTES。首先，对EVs进行用血小板特异性（CD61）和红细胞特异性（CD235a）抗原染色。接着，通过大小排斥层析从血浆中分离染色的EVs，以降低可溶性蛋白、脂蛋白和未结合试剂的浓度。分离完成后，通过过滤PEVTES以去除残余的血小板。同时，PEVTES采用冷冻保存剂、二甲亚砜（DMSO）、甘油或海藻糖进行稀释，最终在-80℃条件下保存12个月。

为验证PEVTES的稳定性，我们在冷冻前及在-80°C保存1、3、6和12个月后的时间点，利用流式细胞仪测量染色的EVs浓度，并对其流速、荧光信号及光散射信号进行校准。制备PEVTES的各个步骤进行了详细的示意。步骤包括人血浆的收集与制备、染色程序、尺寸排除层析以及利用08μm孔径的聚碳酸酯过滤器去除残留的血小板。

通过实验结果，我们发现，冻融之后的CD61+EVs在DMSO中保存12个月的测量浓度下降了33%，而在甘油和海藻糖中则分别增加了9%和6%。同样，对于CD235a+EVs，DMSO、甘油和海藻糖中浓度的下降幅度为约70%、23%和15%。在乳酸粘附素+EVs的浓度上，DMSO中分别下降了23%，甘油中下降了28%，海藻糖中下降了19%。这些结果充分表明了PEVTES的稳定性。

综上所述，PEVTES具备以下优点：1) 与血浆中的亚细胞颗粒特性相似，2) 使用简便，3) 与纳米流式细胞术兼容，4) 具备良好的稳定性。因此，开发的PEVTES是验证新参考物及程序的理想候选材料，能够为相关研究提供坚实支持。同时，通过使用尊龙凯时产品，研究人员能够更高效地进行EVs的分析，以推动生物医学领域的发展。